2017医学硕士研究生开题报告范文

时间:2017-05-26 编辑:hjh 手机版

  一、立题依据(科学意义及国内外现状分析及参考文献)

  恶性黑色素瘤是一种高度恶性且最具侵袭性的癌之一,多发生于皮肤,早期发生血行转移。对放、化疗不敏感,在世界范围内发病率增高,人们一直在期待着可以征服恶性黑素瘤的新的疗法的出现!

  最近大量的数据表明恶性肿瘤的发展与T-钙粘蛋白的表达变化相关.T-钙粘蛋白已在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌[1-3] 、胃癌、胰腺癌、卵巢癌[4-9]等多种恶性肿瘤中被检测到表达减少.最近的研究表明T/H—钙粘蛋白在乳腺癌中的重新表达能抑制肿瘤细胞的生长,降低体外培养的肿瘤细胞的侵袭潜能[1].T/H—钙粘蛋白这个新型钙粘蛋白分子在人类许多癌细胞中表达都降低表明它或许在肿瘤细胞的侵袭和转移[10]及维持正常细胞的表型中起重要作用[11].

  T/H—钙粘蛋白与肿瘤的发生、发展有着密切的联系,也许它会为肿瘤的诊断和治疗带来新的契机.

  T-钙粘蛋白是否对恶性黑色素瘤也有作用,目前还没有相关研究的报道,所以本实验将进行相关方面的探讨性研究!

  二、研究内容及预期成果(说明具体研究内容、创新点及拟解决的关键问题、预期成果及提供形式)

  研究内容:

  第一部分:正常表皮组织、痣细胞及黑色素瘤细胞中T-cadherin表达情况

  第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表达载体的构建

  第三部分:T-cadherin基因的真核表达及生物活性分析

  创新点:首次将T-cadherin基因转染黑素瘤细胞

  拟解决的关键问题:通过RT-PCR反应扩增出T-cadherin的基因全长。

  预期成果及提供形式:

  观察T-钙粘蛋白在正常皮肤组织细胞、痣细胞及黑色素瘤细胞中的表达情况!

  进一步阐明T-钙粘蛋白作用机制

  T-钙粘蛋白基因转染入黑色素瘤细胞后观察对其增殖和转移活性的抑制情况,探索临床诊断和治疗黑色素瘤及其它肿瘤的方法!

  三、研究方案(包括研究方法、技术路线、研究进度安排)

  研究方法:

  第一部分:正常表皮组织、痣细胞及黑色素瘤细胞中T-cadherin表达情况

  免疫组织化学和免疫细胞化学

  1.材料:从正常人皮肤切取的痣组织,人黑色素瘤细胞株

  2.主要试剂和溶液

  (1)第一抗体:兔抗人T-cadherin 抗体

  (2)第二抗体:生物素标记羊抗兔IgG

  (3) “三抗” :链亲和霉素标记HRP

  3.设备

  4.方法

  (1)冷冻切片的免疫染色程序

  (2)活细胞的免疫染色程序

  5.荧光显微镜检

  注意:为保证结果的可靠性应该同时设有对照

  阳性对照(正常组织) ;

  阴性对照(PBS代替一抗)以证明抗体的特异性。

  第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表达载体的构建

  1.材料:

  (1)组织和细胞

  (2)菌株与质粒

  (3)工具酶

  (4)试剂

  (5)仪器

  2.方法

  (1)引物的设计

  (2)总RNA的提取:异硫氰酸-酚-氯仿抽提一步法

  (3)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析其质量,观察所提RNA有无明显降解;

  (4)逆转录RT反应 :为了证实RT反应的成功设管家基因GAPDH为内对照

  (5)PCR扩增 :利用上下游引物,在DNA聚合酶下对目的片段进行扩增,PCR过程设β-actin为内对照

  (6)PCR产物的回收、纯化

  (7)PCR产物的克隆

  (8)DNA序列测定

  (9)真核重组表达质粒的构建

  (10)阳性重组质粒的鉴定和筛选

  (11)质粒的大量提取

  (12)转染黑色素瘤细胞


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